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二吡啶酸（DPA）是一种表现出良好抗菌活性的芳香二羧酸，它具有热稳定性、易于生物降解且无毒的特性，因而成为制备植物病原体抗真菌药物的理想原料。然而，天然 DPA 的产生仅限于芽孢杆菌或罕见虫生真菌的产孢期，并且其含量相对较低，加之培养过程复杂繁琐，使得天然 DPA 难以满足实际应用的需求。
传统的化学方法制备 DPA 存在严重的污染问题，成本高昂且不可持续，因此微生物发酵法异源合成 DPA 备受期待。然而，目前报道的工程微生物生产 DPA 的案例主要集中在大肠杆菌和谷氨酰胺杆菌上，但这些菌株的生产性能仍远未达到预期。鉴于此，迫切需要进一步探索和开发更高效环保的 DPA 生产方法，以实现工业化规模的高效生产。
假单胞菌 KT2440 是一种革兰氏阴性的土壤细菌，因其出色的强健性、代谢多样性、遗传可操作性以及在作为宿主微生物时的安全性，被认为是工业发酵领域中最具潜力的代谢工程菌株之一。
假单胞菌 KT2440 主要通过 ED 途径消耗葡萄糖，这一途径能够直接产生 DPA 生物合成所需的丙酮酸和直接前体L-天冬氨酸。同时，该过程还伴随着 1 mol ATP、NADH 以及 NADPH 的释放。其中，NADPH 是众多生物合成反应中不可或缺的重要辅助因子。正因为 ED 途径具备这种天然的代谢通量分流特性，它成为了众多生物合成生产过程中进行工程化菌株改造时的优先选择。
近日，中国科学院微生物研究所的于波团队在相关领域取得了重大突破，填补了研究空白。他们成功地在假单胞菌 KT2440中引入外源 DPA 合成途径，并结合ED 途径，显著提高了合成效率。通过精细的基因工程手段，团队还成功消除了分支途径的干扰，增强了前体物质的供应196体育官方网站。此外，他们还巧妙地通过引入额外的 ATP 生成羧化步骤，有效地弥补了 ED 途径中 ATP 的不足。在 5 L 发酵罐的实验条件下，196体育官方网站经过改造的工程菌株展现出了卓越的性能，高效地利用葡萄糖生产出了高浓度的 DPA，产量高达11.72 g/L，为这一领域的研究开辟了新的方向。
论文首先对假单胞菌 KT2440 通过 ED 途径合成 DPA 的路线作了说明，指出 DPA 生物合成同时需要丙酮酸和直接前体 L-天冬氨酸。
在 ED 途径中196体育官方网站，醛缩酶（Eda）裂解 2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸，生成等量的甘油醛-3-磷酸和丙酮酸。甘油醛-3-磷酸部分转化为磷酸烯醇丙酮酸（PEP），后者在磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PCK）作用下固定 CO₂，快速转化为草酰乙酸。接着，以谷氨酸为氨基供体，通过天冬氨酸转氨酶（AspC）形成 L-天冬氨酸，消耗 ATP 并在天冬氨酸激酶作用下转化为 L-天冬氨酸-4-磷酸，再经天冬氨酸-半醛脱氢酶（Asd）转化为天冬氨酸半醛。同时，丙酮酸经 4-羟基-四氢二吡啶酸合酶作用生成（2S,4S）-4-羟基-2,3,4,5-四氢二吡啶酸（HTPA），最终通过二吡啶酸合成酶转化为 DPA。
▲图 计算机设计假单胞菌 KT2440 中 ED 途径合成 DPA 的路线示意（来源：上述论文）
经过计算机模拟设计代谢通路后，研究团队利用工程化的假单胞菌菌株进行了实验验证。他们发现天冬氨酸半醛是 L-赖氨酸和 L-甲硫氨酸合成的共同前体，并从假单胞菌 KT2440 的基因组中删除了 lysA 和 metX 基因，以阻断竞争途径并防止 L-甲硫氨酸的合成。同时，他们还删除了乳酸脱氢酶基因 ldhA 以防止乳酸的产生，并扩增了 DPA 生产的关键基因dapA 和 dpaAB，从而得到了菌株 PGD04。在全细胞生物转化过程中，初始生物量为 OD600=10 时，DPA 的产量达到了0.32 g/L，且未检测到其他有机酸，这证明了分支途径基因删除的有效性。
此外，研究团队通过过表达天然的天冬氨酸氨基转移酶（AspC 基因）来增加 DPA 的直接前体 L-天冬氨酸的供应，但效果并不明显。于是，他们引入了来自谷氨酸棒状杆菌的突变基因lysCT311I以增强 DPA 生产途径，并删除了可能引向分支途径的高丝氨酸脱氢酶基因 PP_0664。这些修改显著提高了 DPA 产量。
注意到磷酸烯醇丙酮酸被大量分流到三羧酸循环（TCA）后，研究团队敲除了丙酮酸激酶基因（pykA 和 pykF）以节省该代谢物，从而间接改善了 DPA 的合成效率。随后，他们通过过表达谷氨酸脱氢酶基因 gdhA 来增强AspC 的活性，进一步提升了 L-天冬氨酸的供应和 DPA 的产量，使滴度达到0.62 g/L。
在菌株工程之外，研究团队还优化了生产工艺。他们发现微需氧条件更适合 DPA 生产，因为这种条件下假单胞菌能提供更多能量并降低丙酮酸消耗。限制溶解氧水平的实验也证实了这一点，尽管这导致细胞密度降低，但 DPA 的产量显著增加。这也进一步证明了 DPA 具有杀菌作用。
▲图 不同溶解氧水平对菌株生产 DPA 的影响。(a-c) 在 0%、10% 和 30% 溶解氧水平下的 DPA 生产滴度。(d-f) 在 0%、10% 和 30% 溶解氧水平下发酵过程中的细胞生物量变化（来源：上述论文）
研究团队还尝试通过增加 ATP 生成步骤和优化代谢途径来提高 DPA 的生产效率。他们引入了外源性的 PCK 来增加 ATP 供应，并删除了可能影响丙酮酸平衡的 PEP 合成酶基因。然而，实验结果表明这些改变并没有显著提高 DPA 的产量，反而在某些情况下导致了产量下降。他们推测这可能是由于 ATP 供应并不是限制因素，而阻断从丙酮酸到 PEP 的途径可能会扰乱假单胞菌菌株的代谢网络，从而降低了生产性能。
最后，为验证额外 ATP 生成的羧化步骤有利于 DPA 生产，研究团队选择该基因改造的菌株 PGD10 在可控发酵罐中发酵。在高密度发酵条件下，将溶解氧水平降低到 15% 以下，并加入诱导剂 L-阿拉伯糖（2 g/L）以促进 DPA 合成酶表达，与未改造的菌株相比，PGD10 的 DPA 的产量显著增加，48 小时内提高了 41%，并在96 小时滴度达到11.72 g/L，且发酵液中未检测到明显的其他有机酸，当然，值得注意的是，196体育官方网站随着 DPA 的逐渐积累，细胞质量急剧下降。
▲图 菌株 PGD10 在发酵罐中发酵生产二吡啶酸(a) DPA 生产曲线(b) 细胞生长曲线（来源：上述论文）
综上所述，这项研究成果开发了一条全新的 DPA 生产途径，也为假单胞菌 KT2440 工程化改造提供了可借鉴的经验。